沙门氏菌检测

1 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 1。1 冰箱：2℃～5℃。

1。2 恒温培养箱：36℃±1℃,42℃±1℃。 1。3 均质器. 1.4 振荡器.

1。5 电子天平:感量0。1g.

1。6 无菌锥形瓶：容量500ml，250ml。

1.7 无菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头。

1.8 无菌培养皿：直径90mm。

1。9 无菌试管:3mm×50mm、10mm×75mm. 1.10 无菌毛细管。

1.11 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 1。12 全自动微生物生化鉴定系统。 2 培养基和试剂

2。1 缓冲蛋白胨水(BPW）：见附录中1。 2.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB)增菌液：见附录中2. 2。3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液:见附录中3。 2.4 亚硫酸铋(BS）琼脂:见附录中4。 2.5 HE琼脂：见附录中5.

2。6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD）琼脂：见附录中6。 2。7 沙门氏菌属显色培养基. 2。8 三糖铁(TSI）琼脂:见附录中7。 2。9 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录中8。 2。10 尿素琼脂（pH7.2）:见附录中9. 2.11 （KCN）培养基：见附录中10。 2.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录中11.

2。13 糖发酵管：见附录中12。

2.14 邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG）培养基：见附录中13. 2。15 半固体琼脂：见附录中14。 2.16 丙二酸钠培养基：见附录中15. 2。17 沙门氏菌O和H诊断血清。 2。18 生化鉴定试剂盒. 3 操作方法 3。1 试验前准备

3。1。1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管（1ml、10ml）、稀释剂等移至操作室内。准备好足够用量，避免操作中出入操作间。 3。1。2 开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min。 3。1。3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等.

3。1。4 操作前先用乙醇棉球擦手、工作台面，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封. 3。2 前增菌

称取25g(ml）样品放入盛有225ml BPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225ml BPW的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min～2min.若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH值,用1mol/ml无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2.无菌操作将样品转至500ml锥形瓶中,如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8 h~18h.如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min，或2℃～5℃不超过18h解冻。 3。3 增菌

轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1ml，转种于10ml TTB内，于42℃±1℃培养18 h～24h。同时，另取1ml，转种于10ml SC内，于36℃±1℃培养18h~24h。 3.4 分离

分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36℃±1℃分别培养18h~24h(XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40h~48h

（BS琼脂平板）,观察各个平板上生长的菌落。各个平板上的菌落特征见表1.

表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

选择性琼脂平板 BS琼脂 HE琼脂 XLD琼脂 沙门氏菌属显色培养基 沙门氏菌 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。 蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色。 菌落呈粉红色,带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落;有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。 按照显色培养基的说明进行判定。 3。5 生化试验

3.5。1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂,先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h~24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。

表2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果 三糖铁琼脂 斜面 K K A A K 底层 A A A A K 产气 ＋（－) ＋（－） ＋(－) ＋/－ ＋/－ 硫化氢 ＋(－） ＋（－） ＋（－） ＋/－ ＋/－ 赖氨酸脱羧酶试验培养基 ＋ － ＋ － ＋/－ 初步判断 可疑沙门氏菌属 可疑沙门氏菌属 可疑沙门氏菌属 非沙门氏菌 非沙门氏菌 注:K：产碱，A：产酸，＋:阳性,－：阴性;＋(－)多数阳性,少数阴性；＋/－:阳性或阴性。 3.5。2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、(KCN）培养基,也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种.于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果.将已挑菌落的平板储存于2℃~5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。

表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 反应序号 A1 A2 A3 硫化氢(H2S） ＋ ＋ － 靛基质 － ＋ － pH7。2尿素 － － － (KCN) － － － 赖氨酸脱羧酶 ＋ ＋ ＋/－ 注：＋:阳性，－:阴性，＋/－：阳性或阴性。 3。5.2。1 反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属.如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶3 项中有1项异常,按表4可判定为沙门氏菌.如有2项异常为非沙门氏菌。

表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 pH7.2尿素 － (KCN) － 赖氨酸脱羧酶 － 判定结果 甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果） 沙门氏菌IV或V（要求符合本群生化特性) 沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果） － ＋ ＋ ＋ 注：＋：阳性，－:阴性。 － ＋ 3。5。2。2 反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

3。5.2.3 反应序号A3：补做ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶阳性.甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。 3.5。2。4 必要时按表5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。 表5 沙门氏菌属各生化群的鉴别 项 目 卫矛醇 山梨醇 水杨苷 ONPG 丙二酸盐 KCN I ＋ ＋ － － － － II ＋ ＋ － － ＋ － III － ＋ － ＋ ＋ － IV － ＋ ＋ － － ＋ V ＋ ＋ － ＋ － ＋ VI － － － － － － 注：＋：阳性，－:阴性。 3。5。3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据3。5。1的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。 3。6 血清学鉴定 3。6。1 抗原的准备

一般采用1。2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2％~3％）培养基上再检查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了O凝集反应时,可挑取菌苔于1ml生理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查.H抗原发育不良时,将菌株接种在0。55%～0。65%

半固体琼脂平板的，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过装有0.3％～0。4%半固体琼脂的小玻管1 次～2次，自远端取菌培养后再检查。

3.6。2 多价菌体抗原（O)鉴定

在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌,各放1/2环于玻片上的每一区域上部,在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照.再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。

3。6.3 多价鞭毛抗原(H）鉴定同3。6。2. 3.7 结果与报告

综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g(ml）样品中检出或未检出沙门氏菌。

附录 培养基和试剂

1 缓冲蛋白胨水（BPW） 1。1 成分 蛋白胨 氯化钠

10。0g 5。0g 9。0g 1。5g 1000ml 7.2±0。2

磷酸氢二钠（含12 个结晶水） 磷酸二氢钾 蒸馏水 pH

1。2 制法

将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀,静置约10 min，煮沸溶解,调节pH,高压灭菌121 ℃，15min。

2 四硫磺酸钠煌绿（TTB)增菌液 2。1 基础液 蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 碳酸钙 蒸馏水 pH

10。0g 5.0g 3。0g 45.0g 1000ml 7.0±0.2

除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解,再加入碳酸钙，调节pH,高压灭菌121℃,20 min。 2。2 硫代硫酸钠溶液 硫代硫酸钠(含5个结晶水） 蒸馏水

50。0g 加至100ml

高压灭菌121℃，20 min。 2.3 碘溶液 碘片 碘化钾

20。0g 25。0 g

蒸馏水 加至100 ml

将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片,振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。 2。4 0。5％煌绿水溶液 煌绿 蒸馏水

0。5g 100ml

溶解后，存放暗处,不少于1d,使其自然灭菌。 2。5 牛胆盐溶液 牛胆盐 蒸馏水

10。0g 100ml

加热煮沸至完全溶解,高压灭菌121 ℃，20min。 2.6 制法 基础液

900ml 100ml 20.0ml 2.0ml 50。0ml

硫代硫酸钠溶液 碘溶液

煌绿水溶液 牛胆盐溶液

临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分. 3 亚硒酸盐胱氨酸（SC)增菌液 3。1 成分 蛋白胨 乳糖

5。0g 4。0g 10.0g 4。0g 0.01g 1000ml 7.0±0.2

磷酸氢二钠 亚硒酸氢钠 L—胱氨酸 蒸馏水 pH

3.2 制法

除亚硒酸氢钠和L—胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至55℃以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/L L-胱氨酸溶液10ml(称取0。1g L-胱氨酸，加1mol/L氢氧化钠溶液15ml,使溶解，再加无菌蒸馏水至100ml 即成，如为DL—胱氨酸，用量应加倍）。摇匀，调节pH. 4 亚硫酸铋（BS)琼脂 4.1 成分 蛋白胨 牛肉膏 葡萄糖

10.0g 5。0g 5。0g 0。3g 4。0g

0.025g或5。0g/L水溶液5.0ml 2。0g 6。0g 18。0g～20g 1000ml 7.5±0.2

硫酸亚铁 磷酸氢二钠 煌绿

柠檬酸铋铵 亚硫酸钠 琼脂 蒸馏水 pH

4.2 制法

将前三种成分加入300 ml 蒸馏水(制作基础液)，硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20ml和30ml蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20ml和30ml蒸馏水中，琼脂加入600ml蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解.冷至80 ℃左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节pH，随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至50℃~55℃.加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿.

注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性,贮于室温暗处，超过48h会降低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。 5 HE琼脂（Hektoen Enteric Agar） 5。1 成分 蛋白胨

12。0g

牛肉膏 乳糖 蔗糖 水杨素 胆盐 氯化钠 琼脂 蒸馏水

3。0g 12。0g 12。0g 2 。0g 20。0g 5。0g 18.0g~20。0g 1 000ml 16.0ml 20。0ml 20.0ml 20.0ml 7.5±0.2

0.4％溴麝香草酚蓝溶液 Andrade 指示剂 甲液 乙液 pH

5。2 制法

将前面七种成分溶解于400 ml 蒸馏水内作为基础液；将琼脂加入于600 ml 蒸馏水内.然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节pH。再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷至50℃～55℃倾注平皿。

注:①本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性.

②甲液的配制 硫代硫酸钠 柠檬酸铁铵 蒸馏水

34。0g 4。0g 100ml

③乙液的配制 去氧胆酸钠 蒸馏水

10.0g 100ml

④Andrade指示剂 酸性复红

0.5g 16.0ml

1mol/L氢氧化钠溶液

蒸馏水 100ml

将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液.数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1ml～2ml。

6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂 6。1 成分 酵母膏

3。0g 5。0g 3。75g 7.5g 7。5g 2。5g 0。8g 6。8g 5。0g 15。0g 0.08g 1 000ml 7。4±0.2

L—赖氨酸 木糖 乳糖 蔗糖

去氧胆酸钠 柠檬酸铁铵 硫代硫酸钠 氯化钠 琼脂 酚红 蒸馏水 pH

6。2 制法

除酚红和琼脂外,将其他成分加入400ml蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH.另将琼脂加入600ml蒸馏水中,煮沸溶解.将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至 50℃～55℃倾注平皿。

注：本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备，第二天使用。 7 三糖铁（TSI）琼脂 7。1 成分 蛋白胨 牛肉膏 乳糖

20。0g 5.0g 10。0g

蔗糖 葡萄糖

10。0g 1。0g 0。2g

0。025g或5。0 g/L溶液5.0ml 5。0g 0.2g 12.0g 1000ml 7.4±0。2

硫酸亚铁铵（含6 个结晶水） 酚红 氯化钠

硫代硫酸钠 琼脂 蒸馏水 pH

7.2 制法

除酚红和琼脂外,将其他成分加入400ml蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600ml蒸馏水中,煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂,混匀,分装试管,每管约2ml~4ml，高压灭菌121℃10 min 或115℃ 15min，灭菌后置成高层斜面,呈桔红色. 8 蛋白胨水、靛基质试剂 8。1 蛋白胨水

蛋白胨（或胰蛋白胨) 氯化钠 蒸馏水 pH

20.0g

5.0g 1000ml 7.4±0。2

将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH,分装小试管，121℃高压灭菌15min。 8。2 靛基质试剂

8.2.1 柯凡克试剂:将5g对二甲氨基甲醛溶解于75ml戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25ml.

8.2.2 欧-波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95ml95%乙醇内.然后缓慢加入浓盐酸20ml。 8.3 试验方法

挑取小量培养物接种，在36℃±1℃培养1d～2d,必要时可培养4d～5d。加入柯凡克试剂约0。5ml，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧-波试剂

约0。5ml,沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色. 注:蛋白胨中应含有丰富的色氯酸.每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。

9 尿素琼脂（pH 7。2） 9.1 成分 蛋白胨 氯化钠 葡萄糖

1。0g 5.0g 1。0g 2.0g

3。0ml

磷酸二氢钾 0。4％酚红 琼脂 蒸馏水

20。0g 1000ml 100ml 7.2±0.2

20％尿素溶液 pH

9.2 制法

除尿素、琼脂和酚红外,将其他成分加入400ml蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600 ml 蒸馏水中,煮沸溶解.将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂后分装，121℃高压灭菌15min。冷至50℃～55℃，加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%.分装于无菌试管内，放成斜面备用. 9。3 试验方法

挑取琼脂培养物接种,在36℃±1℃培养24h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。 10 （KCN）培养基 10。1 成分 蛋白胨 氯化钠

10.0g 5。0g 0。225g 5。g 1000ml

磷酸二氢钾 磷酸氢二钠 蒸馏水

0。5％ 10。2 制法

20。0ml

将除以外的成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，分装后121℃高压灭菌15min。放在冰箱内使其充分冷却。每100ml 培养基加入0。5%溶液2。0ml（最后浓度为1：10000)，分装于无菌试管内,每管约4ml，立刻用无菌橡皮塞塞紧,放在4℃冰箱内,至少可保存两个月。同时，将不加的培养基作为对照培养基,分装试管备用. 10.3 试验方法

将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取1环接种于（KCN）培养基。并另挑取1环接种于对照培养基.在36℃±1℃培养1 d～2 d，观察结果。如有细菌生长即为阳性（不抑制），经2d细菌不生长为阴性（抑制)。 注:是剧毒药,使用时应小心,切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严，逐渐分解,产生氢氰酸气体逸出,以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。

11 赖氨酸脱羧酶试验培养基 11.1 成分 蛋白胨

5。0g 3。0g 1。0g 1000ml 1.0ml

0。5g/100ml 或1.0g/100ml 6.8±0。2

酵母浸膏 葡萄糖 蒸馏水

1.6％溴甲酚紫—乙醇溶液 L-赖氨酸或DL-赖氨酸 pH

11.2 制法

除赖氨酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100ml，分别加入赖氨酸.L—赖氨酸按 0。5%加入，DL—赖氨酸按1％加入。调节pH。对照培养基不加赖氨酸.分装于无菌的小试管内，每管0。5ml，上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min.

11。3 试验方法

从琼脂斜面上挑取培养物接种,于36℃±1℃培养18h～24h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱,培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物,但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。 12 糖发酵管 12。1 成分 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠

5.0g 10。0g 3.0g 2。0g 12。0ml 1000ml 7。4±0.2

磷酸氢二钠（含12个结晶水) 0。2％溴麝香草酚蓝溶液 蒸馏水 pH

12.2 制法

12。2。1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，调节pH。按0。5％加入葡萄糖,分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15min。

12。2。2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100ml，121℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10％溶液，同时高压灭菌。将5ml糖溶液加入于100ml培养基内，以无菌操作分装小试管。

注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌.

12.3 试验方法：从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36℃±1℃培养，一般2d~3d。迟缓反应需观察14d～30d。 13 ONPG 培养基 13。1 成分

邻硝基酚β—D半乳糖苷(ONPG）

60.0mg

0。01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7。5） 10。0ml 1%蛋白胨水（pH7.5) 13.2 制法

将ONPG溶于缓冲液内,加入蛋白胨水,以过滤法除菌，分装于无菌的小试管

30.0ml

内，每管0。5ml，用橡皮塞塞紧. 13.3 试验方法

自琼脂斜面上挑取培养物1 满环接种于36℃±1℃培养1h～3h 和24h 观察结果.如果β-半乳糖苷酶产生,则于1h~3h 变黄色,如无此酶则24h不变色. 14 半固体琼脂 14.1 成分 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 琼脂 蒸馏水 pH

0.3g 1。0g 0。5g 0.35g~0。4g 100ml 7.4±0。2

14.2 制法

按以上成分配好，煮沸溶解,调节pH。分装小试管。121℃高压灭菌15min。直立凝固备用。注：供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。 15 丙二酸钠培养基 15。1 成分 酵母浸膏 硫酸铵

1.0g 2。0g 0。6g 0。4g 2。0g 3。0g 12。0ml 1000ml 6。8±0.2

磷酸氢二钾 磷酸二氢钾 氯化钠

丙二酸钠

0。2％溴麝香草酚蓝溶液 蒸馏水 pH

15.2 制法

除指示剂以外的成分溶解于水，调节pH，再加入指示剂，分装试管，121℃高压灭菌15min。

15。3 试验方法

用新鲜的琼脂培养物接种，于36℃±1℃培养48h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。