鹅细小病毒HN株的分离鉴定及全基因组序列分析

鹅细小病毒ＨＮ株的分离鉴定及全基因组序列分析　贺冬梅ｈ。，谭树义　，陈朝喜　，叶保国　，张　艳　，林哲敏　，曹宗喜　（１．海南省农业科学院畜牧兽医研究所，海南海口５７１１００；２．西南民族大学生命科学与技术学院，Ｎ　Ｊｌｌ成都６１００４１）　摘　要：为研究鹅细小病毒（ＧＰＶ）基因遗传变异特征，采集海南某养鹅场疑似鹅细小病毒感染的病料，　将其处理后接种番鸭胚成功分离到一株病毒，经ＰＣＲ鉴定为鹅细小病毒，命名为ＨＮ株，并获得了其全基因　组序列，将该序列与ＧｅｎＢａｎｋ数据库中登录的１６条鹅和番鸭细小病毒基因序列进行了比对分析。结果显　示，该株病毒基因组全长为５　１０６　ｂｐ，由ＩＴＲ、ＮＳ、ＶＰ构成，其中ＩＴＲ为４４４　ｂｐ，ＮＳ１为１　８４４　ｂｐ，ＶＰ１为　２　１９９　ｂｐ；ＨＮ株与ＳＨＦＸ１２０１株的ＮＳ１基因和ＶＰ１同源性最高，分别达到９９．８　和９９．７　，与番鸭细小　病毒株ＦＭ的ＮＳ１基因同源性最低，为８２．７　；与９０－０２１５株ＶＰ１同源性最低，为８Ｏ．１　。ＨＮ株的遗传　进化树可以看出，ＧＰＶ可以分成明显的２个基因亚群，ＨＮ株与鹅细小病毒匈牙利株（Ｂ）、欧洲疫苗株　（ＶＧ３２／１）和株（８２－０３２１Ｖ、８２－０３２１、０６—０３２９）均处在第１亚群，且与安徽分离株Ｙ株以及ＳＨＦＸ１２０１株　同源性最接近，番鸭源匈牙利株ＦＭ单独处于第Ⅱ亚群。本研究丰富了ＧＰＶ的数据资料，为研究ＧＰＶ分　类地位以及遗传进化关系提供了依据，同时也为研究ＧＰＶ流行趋势和疫苗的开发奠定了基础。　关键词：鹅细小病毒；分离鉴定；全基因组；ＩＲＴ；ＮＳ１；ＶＰ１　中图分类号：￥８５２．６５９．２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００７—５０３８（２０１６）１２—００１３—０６　鹅细小病毒病又称小鹅瘟（Ｄｅｒｚｓｙ　Ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｏｒ　的防控奠定基础。　Ｇｏｓｌｉｎｇ　ｐｌａｑｕｅ），是由鹅细小病毒（Ｇｏｏｓｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，　１材料与方法　ＧＰＶ）所引起的雏鹅急性或亚急性的败血性传染病。　１．１材料　临床上以精神委靡，离群独偶，鼻孔流出浆液性鼻液，　１．１．１样品　由本实验室采集并保存的海南某养鹅　患鹅频频摇头，拉灰黄色或黄绿色稀粪，神经紊乱，小　场疑似ＧＰＶ感染雏鹅组织（肝脏、脾脏等组织样品）。　肠中后段黏膜坏死脱落与纤维素性渗出物凝固形成　１．１．２试剂　琼脂糖、胶回收纯化试剂盒、ｐＭＤ１８一Ｔ　栓子，形如腊肠状为特征。本病常呈败血经过，发病　载体、大肠埃希菌ＤＨ５ａ感受态细胞、ＬＡ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　率和病死率很高，对养鹅业危害极大＿１　］。ＧＰＶ为单　聚合酶、ＤＮＡ　Ｍａｋｅｒ　ＤＬ　２　０００等为宝生物工程（大　链线性ＤＮＡ病毒，其基因组约５　ｋｂ，在基因组的两端　连）有限公司产品；ＤＮＡ提取试剂盒为生工生物工程　均含有相同的末端倒置重复序列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　（上海）股份有限公司产品。　ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）可折叠形成Ｕ形双链发夹结构，其主要　１．２方法　功能是病毒的复制起点并提供顺式包装信号，中间有　１．２．１　引物设计与合成　根据ＧｅｎＢａｎｋ中ＧＰＶ标　２个开放阅读框，左侧编码非结构蛋白ＮＳ１和ＮＳ２，　准株的全基因组序列设计７对引物，引物均由宝生物　主要参与病毒的复制和转录调节；右侧编码衣壳蛋白　工程（大连）有限公司合成（表１）。　ＶＰ１、ＶＰ２和ＶＰ３，ＶＰ３是ＧＰＶ的免疫保护抗原，能　１．２．２样品处理采集发病雏鹅的肝脏和脾脏剪碎　刺激机体产生中和抗体　。］。　研磨，按１：３加入灭菌生理盐水，反复冻融３次，　本研究通过在海南疑似鹅细小病感染的病料中　５　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ取上清液，用０．２２　ｍ微孔　分离到１株疑似鹅细小病毒，进行分离鉴定后确定为　滤器过滤除菌，置一７Ｏ℃保存备用［５］。　鹅细小病毒，且命名为ＨＮ株，并对其全基因组序列　１．２．３病毒分离鉴定将冻存疑似ＧＰＶ样品用前　进行分析，丰富了我国鹅细小病毒基因组数据资料，　加入终浓度为１０　０００　ＩＵ的青霉素和链霉素４℃感作　为研究该病的流行、基因遗传进化特征及指导小鹅瘟　１　ｈ，接种１０日龄健康鹅胚（０．３　ｍＬ／枚），弃去２４　ｈ内　收稿日期：２０１６—０５—２３　基金项目：海南省属科研院所技术开发研究专项（ＫＹＹＳ－２０１５—１３）；海南省自然科学基金项目（２０１５３０８５）；现代农业产业　技术体系专项资金项目（ＣＡＲＳ－４３）　作者简介：贺冬梅（１９８８一），女，四川简阳人，硕士研究生，主要从事动物病毒学研究。＊通讯作者　１４　动物医学进展２０１６年第３７卷第１２期（总第２８２期）　死亡的鹅胚，收取２４　ｈ后死亡的鹅胚尿囊液，盲传３　扩增。ＰＣＲ扩增反应条件：９４℃３　ｒａｉｎ；９４℃３０　ｓ，５２　。Ｃ　３０　ｓ，７２℃１５０　ｓ，共３０个循环；７２℃延伸１０　ｍｉｎ。　代，置一２Ｏ℃保存，并将培养物进行ＰＣＲ检测＿６　］。　１．２．４　ＰＣＲ鉴定按照ＤＮＡ抽提试剂盒说明进行　ＤＮＡ提取，ＰＣＲ反应体系为ＬＡ　Ｔａｑ　１０　Ｌ，上、下游　引物各１肛Ｌ，ＤＮＡ　２　Ｌ，灭菌双蒸水６　Ｌ，直接进行　ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应条件：９４。Ｃ　３　ｍｉｎ　９４。Ｃ　３０　ｓ，５２　取ＰＣＲ产物２００　Ｌ，在１０　ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶上电泳。　将ＰＣＲ产物经胶回收试剂盒纯化后与ｐＭＤ１８一Ｔ载　体连接，转化大肠埃希菌ＤＨ５ａ感受态细胞，经氨苄　西林筛选和菌液ＰＣＲ鉴定后，取阳性菌液送上海英　骏生物技术公司进行测序　］。用Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ　７．１软件　℃３０　ｓ，７２℃３０　ｓ，共３Ｏ个循环；７２℃延伸１０　ｍｉｎ。　１．２．５　全基因组的扩增、克隆及序列测定　按照　进行序列拼接，并将拼接后的全基因序列向ＧｅｎＢａｎｋ　提交，进行序列分析。　ＤＮＡ抽提试剂盒说明进行基因组ＤＮＡ提取，将提取　物进行ＰＣＲ，反应体系：ＬＡ　Ｔａｑ　１０　Ｌ，上、下游引物　各１　Ｌ，ＤＮＡ　２肛Ｌ，灭菌双蒸水６　Ｌ，直接进行ＰＣＲ　１．２．６鹅细小病毒参考毒株病毒参考株见表２。　本分析中使用的细小　表１本研究所用引物　Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　冬悔等：鹅细小病毒Ｈ　株的分离鉴定及个＝　列分析　２绐　果　２．１　（　ＰＶ分离鉴定　（　ＰＶ的Ｆ　Ｒ为　Ｊ『物进行ＰＣＲ检测（图１），然后将　检测为　２样　接种鹅胚，夕Ｅ亡鹅胚头部和背部出　ＶＰ２（２　８７４　４　６３７　ｎｔ）坫【夫ｌ编码５８７个氨基酸．ＶＰ３　（３　０３３—４　６３７　ｎｔ）琏１人ｌ编码５３，１个氰基酸，　其　ｆ｛Ｊ！ｌＪ　的ＩＴＲ前柑１个Ｐｏｌｙ（Ａ）的尾。　将疑似（　Ｉ　Ｖ感染的病料进行ＤＮＡ提取后，以　◆十十◆＋　Ｍ　ｌ　２　３　４　５　６　ＩｎＬ（　２），收鹅胚培养物进行ＰＣＲ检测（图３）。由　ｌ、　３　ｌＩｊ‘　，愉｛『Ｊ！ｊｌ样晶有约４７（）ｂｐ的Ｈ的条带出　观．‘ｊ颅　大小一致。　－置　Ｍ．ＤＮＡ标准Ｉ）Ｉ　２　０００；ｊ～３．病料处理样品；ｔ．阴性列　Ｍ．Ｉ）　Ａ　Ｍａｌ‘ｋｅｒ　Ｉ）１　１　００ｏ：１：｛．Ｉ　（、Ｒ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　１　ｒｅａ　ｒｅｄ　ｓａｍｐｌｅｓ　１．　ｔ、　¨ｌＩ、’ｒ【（｝Ｉｌ１．ｒｏｌ　图１　病料ＰＣＲ扩增结果　Ｆｉｇ．ｊ　Ｐ（、Ｒ　ａ　ｒｎｌ｝ｌｉｆｉ｛’ａｌｉｏ　ｒ１　ｒｅｓｕｌｔｓ（）ｆ　ｓａｍｐｌｅｓ　图：接霉后死亡的鹅胚　Ｆｌｇ．！　Ｉ）　ａｄ￣ｏｏｓｅ　Ｌ、ｉｌ１ｌ｝ｒｙＯ　ａｆｌｃ　ｒ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅ　２．２全基因组特征　Ｇｔ’Ｖ　Ｉ＿ＩＮ株经ＰＣＲ扩增后扶得其全基因组序　列．各片段人小分别为０．２、０．５、１．０、１．１、１．２、１．５　ｋｔ　．结果与预期的片段大小　致（图４）。获得ＧＰＶ　｝¨Ｉ　株坫　绀　Ｋ为５　ｌ（）６　．并ｒｆ１　ＩＴＲ、ＮＳ、ＶＰ　构成．其【ｆｌ　ＮＳ１为ｌ　８　ｌ　１　ｂｐ．ＶＰ１为２　１　９９　ｈｐ，符合　（　Ｉ　Ｖ的结构特征．　２（）ｌ１年　安徽分离的Ｙ株　以及２（）ｌ　２年　＿大鹅卜分离到的ＳＨＦＸＩ２Ｏ１株的全　艇【太１　ＩＭ源性最高．分别为９［）．３　和９９．６　。该株　病毒仃左　侧两个开放『蒯读框．左侧编码非结构　货｝　１（ＮＳ１和ＮＳ２）．右侧编码结构蛋白（ＶＰ１、ＶＰ２　干¨Ｖｔ　３）。其结构　门基　ＮＳ１（５３７　２　４２０　ｎｔ）主要　编码６２７个氰綦酸，ＮＳ２编码４５１个氨基酸；其衣壳　生门基　ＶＩ　ｌ（２，ｔ　３９　４　６３７　ｎｔ）编码７３２个氨基酸。　２　０（）（）ｂＤ—　８８８８＝　：＝　Ｉ｛）Ｉ１　ｂｂ—◆　Ｍ．ＤＮＡ标准１）１　：＇１（１【）；ｌ～５，培养物样　１１；ｌｊ．阴　Ｉｑ－对照　Ｍ．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　１）ｉ　！｜１（】（　；１　．Ｉ】Ｌ、Ｉｔ　ｐｒｏｄｕ｛　ｌｓ　ｏｆ　ｃｕｈｕｌ。　ｓａｍｐｈ－　６．Ｎｅｇａｔｉ￣　ｔ｜　（ｗ１ｔ　ｒｏＩ　图３培养物Ｉ　Ｌ、Ｒ扩增结果　Ｆｉｇ．３　Ｉ　【、Ｉｔ　Ｉ　ｌｒ１１Ｉ）ｌｉｆｌｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕ［１　ｏｆ　ｃｕｈｔｌ　ｒｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　Ｍ　ｌ　２　３　４　５　６　１　Ｉ　㈨　”　Ｍ．Ｉ）ＮＡ　｛：Ｉ）ｌ　２（）㈤：【＾。　。垠　增　物　Ｍ．ＤＮＡ　Ｍａｒｋ￣　ｒ　Ｉ）Ｉ，２　０００；ｔ　６．Ｉ　Ｌ、Ｉ　Ｉ）ｒｏｄｔＫ、ｌ　ｏｆ　Ｌ　‘）ＴｌｌＩ）ｌ　ｔ　ｇ（　ｎ［】ｍ　Ｌ－ｓ　图ｒ１　ＨＮ株全基因组ＰＣＲ扩增结果　Ｆｉｇ．４　１　（、Ｒ　ａｍｌ｝ｌｉｆｉｃ￣ｔｔｉｏｎ　ｒｅｓｔｔｌｔ　ｏｆ　ｒ（）１ｎｐｌ｛－ｌ　ｇｅｌ１（）ｎ１　ｏｆ　ｌ’ｔＮ　ｓ１　ｒｏＩ　ｚ１　２．３　（　Ｉ　Ｖ非结构蛋白遗传进化分析　利川１．ａｓｅｒｇｅｎｅ　７．１软什将拼接好的Ｈ　侏的　非结构监¨　ｌ夫】　（　ｆｌ￣ａｎｋ臀求的其他鹅细小病　毒非结构　“：　进　比较分析（衷３）。从表中叮　知Ｈ　株　ｌｊ　ＨＢＺＦＯ７卡术、８２【）３２１侏、Ｏ６一（）３２９株、Ｂ　株、Ｙ株、Ｅ株、ＳＨＦＸ１　２（）ｌ休和ＹＺ９９—６株ＮＳ１基　因的核计酸ＩＩ＿１＝Ｊ源性为９９　～９９．８　．推导其氨基酸　的同源性为９９．２　０／。～１（）（）　。试验侏　ＳＨＦＸｌ２（）ｌ　的同源性最离达剑【）９．８　．　ｊ番鸭细小病毒株ＦＭ　的ＮＳ］揍　Ｍ源性最低为８２．７　。从　５的ＨＮ　株ＮＳ１　Ｉ夫Ｊ的遗传进化树町以７亍出．（；Ｉ’Ｖ在ＮＳ１　基因可以分成叫　的２个坫　、Ｉ　群。Ｉ｛Ｎ株与鹅细　小病毒匈，才利株（Ｉ３）、瞅洲疫时株（Ｖ（；３２／１）和　株（８２—０３２１　Ｖ、８２－０３２１、０６　ｏ３２９）均处　第１哑群．　番鸭源匈牙利株ＦＭ单独处于第ｌ１　群。Ｈ　株与　安徽分离株Ｙ以及ＳＨＦＸ１　２（）１株同源性最接近。　１６　动物医学进展２０１６年第３７卷第１２期（总第２８２期）　ＨＮ　ＫＣ１７８５７１　Ｙ　ＫＣ４７８０６６　ＳＨＦＸｌ２Ｏｌ　ＫＣｌ８４ｌ３３　Ｅ　ＫＣ９９６７３Ｏ　ＹＺ９９－６　ＥＵＯ２２７５　５　ＨＢＺＦ０７　ＥＵ５８３３９０　８２－Ｏ３２１　ＥＵ５８３３９　１　０６．０３２９　ＧＰＵ２５７４９　Ｂ　ＥＵ５８３３９２　ＶＧ３２／１　ＥＵ５８３３８９　８２．Ｏ３２１Ｖ　ＡＦ４１６７２６　ＧＰＶ－ＹＧ　ＡＹ５０６５４６　ＨＧ５／８２　ＥＵ２５３４７９　ＬＮ－ｌ／０６　ＨＯ８９１８２５　ＧＤＯＧＰＶ　ＪＦ３３３５９０　ＳＨ　ＢＤＵ２２９６７　ＭＤＰＶ　ＦＭ　１０．４　１０　８　６　４　２　０　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ（１００Ｘ）　图５　ＨＮ株的ＮＳ１基因遗传进化树　Ｆｉｇ．５　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ＮＳ１　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ＨＮ　ｓｔｒａｉｎ　２．４　ＧＰＶ结构蛋白遗传进化分析　通过与其他株的对比（表４）可知试验株与８２一　０３２１株、０６—０３２９株、Ｙ株、Ｅ株、ＳＨＦＸ１２０１株和　ＹＺ９９—６株基因的同源性为９９．２　～９９．７　，推导　氨基酸的同源性为９９．０　～９９．６　，其中与　ＳＨＦＸ１２０１株同源性最高，与９０—０２１５株同源性最　低。从遗传进化树（图６）可以看出ＨＮ株与分离株　Ｙ株以及ＳＨＦＸ１２０１株同源性最近。且与标准株Ｂ　株和Ｅ株等处于同一基因亚群，９０—０２１５株与ＦＭ　株处于单独的一基因亚群。　表３　ＨＮ株与其他毒株的ＮＳ１基因核苷酸和推导氨基酸序列的同源性比较　Ｔａｂｌｅ　３　Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ａｎｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＮＳ１　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ＨＮ　ｓｔｒａｉｎ　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ｓｔｒａｉｎｓ　注（Ｎｏｔｅ）：１．ＨＮ；２．Ａ　４１６　，２６　Ｇ上ＪＶ—ＹＧ；３．ＡＹ５０６５４６　ＨＧ５／８２；４．ＢＤＵ２２９６　，ＭＤ上ＪＶ　Ｍ；５．１６ｕ０２２／５５　ＨＢＺｂ０７；６．匕ｕ２５３４７９　ＬＮ一１／０６；　７．ＥＵ５８３３８９　８２—０３２１Ｖ；８．ＥＵ５８３３９０　８２—０３２１；９．ＥＵ５８３３９１　０６—０３２９；１０．ＥＵ５８３３９２　ＶＧ３２／１；１１．ＧＰＵ２５７４９　Ｂ；１２．ＨＱ８９１８２５　ＧＤａＧＰＶ；１３．ＪＦ　３３３５９０　ＳＨ；１４．ＫＣ１７８５７１　Ｙ；１５．ＫＣ１８４１３３　Ｅ；１６．ＫＣ４７８０６６　ＳＨＦＸ１２０１；１７．ＫＣ９９６７３０　ＹＺ９９—６．　３　讨论　鹅细小病毒病是一种传染性极强的传染病，既　能传染鹅也能传染番鸭，对于养殖业造成了极大的　危害，因此ＧＰＶ的分离鉴定、遗传进化分析以及疫　苗的研制成为重点。目前，ＧＰＶ的分离主要通过接　种鹅胚、番鸭胚或鹅胚成纤维细胞进行。周彩显　等ｍ　通过接种１０日龄鹅胚成功分离到６株ＧＰＶ；　邱娜等口嵋通过采用不同代次的鹅胚成纤维细胞连　续培养ＹＮ株ＧＰＶ的方法，获得了高滴度的鹅细　小病毒细胞适应株，本试验通过尿囊腔接种番鸭胚，　成功分离到１株疑似ＧＰＶ，通过ＰＣＲ验证为ＧＰＶ，　并命名为ＨＮ株。匈牙利强毒株Ｂ株、安徽Ｙ株、　贺冬梅等：鹅细小病毒ＨＮ株的分离鉴定及全基因组序列分析　１７　注（Ｎｏｔｅ）：１．ＨＮ；２．ＡＦ４１６７２６　ＧＰＶ—ＹＧ；３．ＡＹ３８２８９１　９０—０２１５；４．ＡＹ５１２８３０　ＧＤ；５．ＢＤＵ２２９６７　ＭＤＰＶ　ＦＭ；６．ＥＵ０８８１０１　ＳＣｈ；７．ＥＵ５８３３８９　８２—０３２１Ｖ；８．ＥＵ５８３３９Ｏ　８２—０３２１；９．ＥＵ５８３３９１　０６—０３２９；１０．ＥＵ５８３３９２　ＶＧ３２／１；１１．ＧＰＵ２５７４９　Ｂ；１２．ＨＱ８９１８２５　ＧＤａＧＰＶ；１３．ＪＦ３３３５９０　ＳＨ；　１４．ＫＣ１７８５７１　Ｙ；１５．ＫＣ１８４１３３　Ｅ；１６．ＫＣ４７８０６６　ＳＨＦＸ１２０１；１７．ＫＣ９９６７３０　ＹＺ９９—６．　ＨＮ　ＫＣ４７８０６６　ＳＨＦＸ　１２Ｏ１　ＫＣ１７８５７ｌ　Ｙ　ＥＵ５８３３９０　８２．０３２１　ＥＵ５８３３９　１　Ｏ６．０３２９　ＫＣ９９６７３　０　ＫＣ１８４１３３　Ｅ　ＡＦ４１６７２６　ＧＰＶ－ＹＧ　ＨＯ８９１８２５　ＧＤＯＧＰＶ　ＡＹ５１２８３ＯＧＤ　ＥＵＯ８８ｌＯ１　ＳＣｈ　ＪＦ３３３５９０　ＳＨ　ＥＵ５８３３８９　８２．Ｏ３２１Ｖ　ＥＵ５８３３９２　ＶＧ３２／１　ＧＰＵ２５７４９　Ｂ　ＡＹ３８２８９　ｌ　９０．Ｏ２　１５　ＢＤＵ２２９６７　ＭＤＰ　Ｖ　ＦＭ　１１．７　８　６　４　２　０　Ｎｕｃ　ｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ（１　００×）　图６　ＨＮ株的ＶＰ１基因遗传进化树　Ｆｉｇ．６　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ＶＰ１　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ＨＮ　ｓｔｒａｉｎ　ｂｐ；欧洲ＶＧ３２／１株和安徽Ｅ株都为４４３　ｂｐ；中国　本研究通过将ＧＰＶ　ＨＮ株与ＧｅｎＢａｎｋ上的各　ＧＰＶ的非结构蛋白和结构蛋白相对比，发现ＮＳ１　地方分离株０６—０３２９、８２—０３２１、８２－ｏ３２１Ｖ在　ＩＴＲ区分别为４１８、４１６、３８１　ｂｐ；安徽Ｙ株和Ｅ株分　别为４４４　ｂｐ和４４３　ｂｐ；ＨＮ株的ＩＴＲ区与安徽Ｙ　株相同，各株ＮＳ１基因区和ＶＰ１基因区相对较稳　定。从以上目前分离到的不同毒株来看，ＧＰＶ的结　基因和ＶＰ１基因的遗传较稳定口　，但是ＨＮ株与　两株国内南方分离株Ｙ株和ＳＨＦＸ１２０１株同源性　最高并且属于同基因亚群，造成这一现象的原因可　能是近年来养鹅业和养鸭业的不断扩大，海南省从　南方各地区引进鹅苗和番鸭苗，导致鹅群和番鸭群　携带的ＧＰＶ进人海南省而出现毒株同源性高。　构的不同对其致病力是有影响的ｌ＿】　，作为ＧＰＶ的　免疫保护抗原，能够刺激机体产生中和抗体的ＶＰ１　基因具有相对较高的保守性，其常常作为ＧＰＶ分　子生物学诊断以及遗传进化分析的依据ｎ　，这都有　待于进一步的研究。　海南省从２Ｏ世纪７Ｏ年代以来，在海口、三亚、　保亭、昌江、陵水、澄迈、儋州等地先后有鹅细小病毒　流行的报道，但是对鹅细小病毒的研究只是局限在　１８　动物医学进展２０１６年第３７卷第１２期（总第２８２期）　浩，胡振林，等．鹅细小病毒吉林株的分离鉴定及　诊断、防控与部分基因片段的研究，王德富等ｌ＿１　对　海南地区的小鹅瘟病做了诊断与防控的相关报道；　曹宗喜等　¨　对海南分离的３株鹅细小病毒ＶＰ３基　因进行了分析。本文首次对鹅细小病毒海南分离株　进行全基因组分析，丰富了我国鹅细小病毒基因组　数据资料，可为海南省鹅细小病毒的防控提供理论　依据。　参考文献：　［１］杨焕章，王凯，陈绍红，等．鹅细小病毒ＶＰ３亚单位疫苗的制　［８］　孟繁兴，董其全基因序列分析［Ｊ］．中国兽医杂志，２ｏ１５，５１（１２）：３３—３５，　３８．　［９］　赵瑞宏，沈学怀，戴银，等．抗番鸭细小病毒卵黄抗体的制备　［Ｊ］．安徽农业科学，２Ｏ１５，４３（２９）：６２—６３．　［１ｏ］　周彩显，吴吴，于晶，等．６株鹅细小病毒的分离及其ＶＰ３　基因序列分析［Ｊ］．中国兽药杂志，２０１６，５Ｏ（３）：１－５．　［Ｉ１２　邱娜，刘明，白小飞，等．鹅细小病毒鹅胚成纤维细胞适应　病毒株的培育及序列分析［Ｊ］．中国预防兽医学报，２０１４，３６　（１１）：８９８　９００．　ｅｎ　Ｊ，Ｗａｎｇ　Ｙ，Ｃｈｅｎ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　［１２］　Ｓｈｉｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｌｉｖｅ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｇｏｏｓｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｄｅ—　备及其免疫效果［Ｊ］．动物医学进展，２０１３，３４（１０）：４１—４５．　［２］张颖，鲁承，赵文婧，等．鹅细小病毒ＹＢＬＪ株ＶＰ３基因的　ｖｅｌｏｐｅｄ　ｉｎ　Ａｓｉａ　ａｎｄ　Ｅｕｒｏｐｅ［Ｊ］．Ａｖｉａｎ　Ｐａｔｈｏｌ，２００８，３７（５）：　４９９－５０５．　真核表达［Ｊ］．动物医学进展，２Ｏ１２，３３（１２）：２３—２５．　［３］胡自立，刘海玲，张光明，等．鹅细小病毒ＳＳ／１０株ＶＰ３蛋白的　ｕ　Ｈ　Ｍ，Ｗａｎｇ　Ｈ，Ｔｉａｎ　Ｘ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　［１３］　Ｌｉｏｆ　ｇｏｏｓｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ　Ｙ　ｓｔｒａｉｎ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｍｕｓｃｏｖｙ　ｄｕｃｋｓ　ｉｎ　原核表达及鉴定［Ｊ］．动物医学进展，２０１２，３３（５）：３５—３８．　［４］　盂繁兴，董浩，胡桂学．鹅细小病毒分子生物学的研究新进展　［Ｊ］．黑龙江畜牧兽医，２０１５（１２上）：６５—６７．　［５］陈翠腾，万春和，傅秋玲，等．樱桃谷肉鸭源鹅细小病毒的分离　与鉴定［Ｊ］．中国家禽，２０１５，３７（２３）：４７—４９．　［６］王郑。徐　萍，李甜甜，等．５株鹅细小病毒分离鉴定及ＶＰ３　Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎ，２０１４，４８（１）：１９９—２０２．　　Ｙ，Ｌｉｕ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　［１４］　Ｚｈａｎｇ　Ｙ，ＬｉＶＰ３一ＥＬＩＳＡ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｏｏｓｅ　ａｎｄ　Ｍｕｓｃｏｖｙ　ｄｕｃｋ　ｐａｒ—‘　ｖｏｖｉｒｕｓ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　Ｍｅｔｈ，２０１０，１６３（２）：４０５—４０９．　基因遗传进化分析［Ｊ］．国外畜牧学：猪与禽，２０１５，３５（１２）：７４—　７６．　［１５］　王德富．小鹅瘟的诊断报告［Ｊ］．畜牧兽医科技信息，２０１０（２）：　８４．　［１６］曹宗喜，叶保国，林哲敏，等．三株鹅细小病毒ＶＰ３基因的克　［７］　王建业，黄　钰，龚建森，等．番鸭细小病毒鹅胚化弱毒株　ＦＺ９１—３Ｏ的全基因组克隆及序列分析［Ｊ］．中国家禽，２ｏ１５，３７　（２２）：４６－４８．　隆和序列研究［Ｊ］．中国家禽，２０１３，３５（１３）：１６—１８．　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｏｏｓｅ　Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ　ＨＮ　Ｓｔｒａｉｎ　ＨＥ　Ｄｏｎｇ—ｍｅｉ　＇。，ＴＡＮ　Ｓｈｕ—ｙｉ　，ＣＨＥＮ　Ｃｈａｏ—ｘｉ　，ＹＥ　Ｂａｏ—ｇｕｏ　，ＺＨＡＮＧ　Ｙａｎ　，ＬＩＮ　Ｚｈｅ—ｍｉｎ　，ＣＡＯ　Ｚｏｎｇ—ｘｉ　（１　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ　ａｎｄ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈａｉｎａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｉｋｏｕ，Ｈａｉｎａｎ，５７１　１００，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＬｉ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆｏｒ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｃｈｅｎｇｄｕ，Ｓｉｃｈｕａｎ，６１００４１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｓｔａｔｕｓ　ｏｆ　ｇｏｏｓｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅｓ（１ｉｖｅｒ，ｓｐｌｅｅｎ　ａｎｄ　ｓｏ　ｏｎ）ｏｆ　ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ　ＧＰＶ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ａ　ｇｏｏｓｅ　ｆａｒｍ　ｏｆ　Ｈａｉｎａｎ　ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ａ　ｖｉｒｕｓ　ｓｔｒａｉｎ　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｏｏｓｅ　ｅｍｂｒｙｏ　ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａｎｄ　ｎａｍｅｄ　ａｓ　ＨＮ　ｓｔｒａｉｎ　ａｆｔｅｒ　ＰＣＲ．Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ，ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｓｉｘｔｅｅｎ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｇｏｏｓｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　Ｍｕｓ—　ｃｏｖｙ　ｄｕｃｋ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ　ｉｎ　ＧｅｎＢａｎｋ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｆｕｌｌ—ｇｅｎｏｍｅ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　ｔｈｅ　ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ（ＩＴＲ）ａｎｄ　ｔｗｏ　ｍａｊｏｒ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅｓ（ＯＲＦ）．ＩＴＲ　ａｔ　ｔｈｅ　５　ａｎｄ　３　ｅｎｄｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｈａｓ　４４４　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（ｎｔ）．Ｔｈｅ　ｌｅｆｔ　ＯＲＦ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　１８８４　ｎｔｓ　ｉｎ　ｌｅｎｇｔｈ，ｔｈｅ　ｒｉｇｈｔ　ＯＲＦ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　１　８８４　ｎｔｓ　ｉｎ　ｌｅｎｇｔｈ．　Ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＨＮ　ｓｔｒａｉｎ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｗｉｔｈ　ＮＳ１　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ＶＰ１　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ＳＨＦＸ１２０１　ｓｔｒａｉｎ，ｗｉｔｈ　９９．８　ａｎｄ　９９．７　，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｎｄ　ｔｈｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＮＳ１　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ＦＭ　ｓｔｒａｉｎ　ａｎｄ　ＶＰ１　ｇｅｎｅ　ｏｆ　９０—０２１５　ｓｔｒａｉｎ　ｗｅｒｅ　ｌｏｗｅｒ，ｗｉｔｈ　８２．７　ａｎｄ　８０．１　，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ＨＮ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＧＰＶ　ｃａｎ　ｂｅ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｗｏ　ｇｅｎｅ　ｓｕｂｓｅｔｓ．ＨＮ　ｓｔｒａｉｎ　ａｎｄ　Ｂ　ｓｔｒａｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｈｕｎｇａｒｙ　ａｎｄ　ＶＧ３２／１　ｓｔｒａｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　ａｒｅ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｕｂｇｒｏｕｐ　Ｉ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｈｏｍｏｌｏ—　ｇｙ　ｗｉｔｈ　Ｙ　ｓｔｒａｉｎ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ａｎｈｕｉ　ａｎｄ　ＳＨＦＸ１２０１　ｓｔｒａｉｎ，ｔｈｅ　Ｍｕｓｃｏｖｙ　ｄｕｃｋ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ　ｏｆ　ＦＭ　ｓｔｒａｉｎ　ｉｓｏ—　ｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｈｕｎｇａｒｙ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｕｂｇｒｏｕｐ　ＩＩ．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ａ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＧＰＶ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｔａｔｕｓ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｌａｉｄ　ｔｈｅ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ＧＰＶ　ｅｐｉ—　ｄｅｍｉｃ　ｔｒｅｎｄｓ　ａｎｄ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｇｏｏｓｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｇｅｎｏｍｅ；ＩＲＴ；ＮＳ１；ＶＰ１